Thèse présentée à Faculté des Sciences de l'Université de Paris

pour obtenir le grade de Docteur es Sciences naturelles

par ¶

 

Gildas Beauchesne

 

Recherches sur les substances de croissance du maïs immature. Séparation de ces substances en trois groupes et isolement d'une "purine active" à partir de l'un de ces groupes

 

soutenue le 27 juin 1961

 

devant la commission d'examen :

Chouard, président

Ulrich, Moyse, examinateurs

 

 

 

INTRODUCTION

 

Le but de ce travail est d'étudier le contenu de l'extrait laiteux du caryopse de Maïs immature, considéré en tant que facteur complexe de croissance.

Les investigations que cette entreprise nécessite reposent sur la culture «in vitro» des tissus végétaux. Cette technique met, à la disposition de la recherche, un moyen d'investigation éprouvé pour explorer le domaine complexe des substances de croissance (GAUTHERET, 1959).

Il existe d'autres types d'essais biologiques, comme le test Avoine de WENT et tous ceux qui en dérivent. Il a été parfois nécessaire d'y recourir. Mais il ne semble pas qu'ils puissent fournir autant de données et de sécurité dans le domaine d'exploitation envisagé que la culture «in vitro» de tissus ou d'organes végétaux, car ce sont seulement des tests de croissance par élongation, alors que les cultures de tissus végétaux donnent des réponses de grandissement cellulaire (auxésis) et de division cellulaire (mérésis).

L'inventaire des travaux effectués pour déceler, isoler et caractériser les substances de croissance présentes dans les extraits naturels, montre que la culture des tissus végétaux est souvent à la base de ces recherches depuis la mise au point de celle technique.

I1 fut une époque où la culture de tissus ou d'organes végétaux paraissait impossible ; toutes les tentatives échouaient. Cependant, ROBBINS en 1922, cultivant des méristèmes radiculaires en ajoutant un autolysat de levure au milieu de culture, obtient, pour la première fois, la multiplication des cellules de ces méristèmes.

S'inspirant de cette technique WHITE, à l'aide d'un milieu contenant également un autolysat de levure, réalise la culture indéfinie de racines de tomates (1934).

Les difficultés contre lesquelles s'étaient brisées foules les tentalives précédentes s'atténuèrent du même coup. En 1939, la technique de culture indéfinie «in vitro» de tissus ou d'organes végétaux était définitivement mise au point par WHITE, par GAUTHERET, par NOBECOURT. Elle pouvait désormais servir d'instrument à l'étude des substances de croissance.

Le présent travail sur les substances de croissance contenues dans l'albumen laiteux de caryopse de Maïs immature, que l'on appellera ici en abrégé lait de Maïs, prend ainsi sa place parmi les nombreux autres travaux similaires.

Il est aisé de mettre en évidence la stimulation de croissance due au lait de Maïs. Mais il est beaucoup plus difficile de déterminer les substances responsables de l'activité de cet extrait brut.

Avant tout, il fallait résoudre les trois questions suivantes :

1° La stimulation de croissance provoquée par le lait de Maïs est-elle due aux seules auxines dont le type est l'acide indole acétique ?

2° Quel rôle attribuer aux acides aminés certainement présents dans ce lait embryonnaire ?

3° Peut-elle être la résultante de l'action de plusieurs substances ?

La réponse à ces trois questions constitue la première étape de cette recherche. Il importe de choisir les tissus végétaux qui serviront à éprouver l'activité du lait de Maïs. Ce choix n'est pas fait, a priori, avant même que la recherche n'ait été engagée. Il est le fruit de l'évolution de la recherche elle-même. Au tissu de Carotte, utilisé dès le début, fut adjoint très tôt le tissu de tubercule de Topinambour. Ce n'est que beaucoup plus tard que le tissu de moelle de Tabac sera introduit comme essai biologique. Topinambour et Tabac ont été choisis à cause de la relative spécificité de leur réponse aux substances de croissance. Les résultats obtenus avec ces différents tissus cultivés sur un milieu contenant du lait de Maïs sont comparés à ceux que donnent les mêmes tissus cultivés seulement en présence d'acide indolacétique (AIA).

Ainsi quelques indices préliminaires sur les substances de croissance du lait de Maïs sont recueillis.

Le lait de Maïs est ensuite soumis à différentes tentatives de fractionnement par des procédés physiques ou chimiques.

Par là sont acquises des précisions qui permettent de faire un choix entre des techniques possibles, soit pour le fractionnement du lait de Maïs, soit pour la préparation des milieux de culture.

Dans une seconde partie est mise au point une technique utilisant les échangeurs d'ions pour la séparation des divers consti-tuants du lait de Maïs.

Ces constituants se trouvent répartis par ce procédé en trois groupes chimiquement différents, actifs sur la croissance des tissus végétaux.

L'analyse des constituants de chaque groupe reste à. faire

Deux de ces groupes retiennent particulièrement l'attention. La stimulation de croissance qu'ils manifestent ne peut être due à des auxines acides ni à des esters de ces corps à l'état libre.

Toutefois, il se montre nécessaire d'apporter une modification et de faire une mise au point de la technique initiale de frac-tionnement sur échangeurs d'ions.

Il fallait empêcher certains changements dans les propriétés physiques du milieu d'échange, qui pouvaient être dommageables pour les substances actives du lait de Maïs.

En conclusion de cette seconde partie, il est donné un aperçu des techniques de fractionnement utilisées par d'autres chercheurs dans le domaine des laits embryonnaires.

La troisième partie expose l'étude des fractions neutre et basique.

L'analyse du groupe «neutre» est faite sommairement. La dialyse et la chromatographie suivie d'un test d'élongation, forment l'essentiel des techniques utilisées dans ce cas. Il faut noter également un essai de fractionnement sur échangeurs basiques forts.

Le groupe basique est au contraire L'objet de tout l'effort de recherche. Une substance quasiment pure en est isolée, mais en quantité trop faible encore pour que l'analyse chimique en puisse être faite.

L'électrophorèse sous ses diverses formes et les échangeurs basiques forts ont permis d'atteindre ce résultat.

Un seul tissu végétal a été utilisé dans cette dernière étape : le tissu de moelle de Tabac.

Les réactions physiologiques de ce tissu vis-à-vis des substances de croissance sont relativement spécifiques. Grâce à cela il a été possible de discerner à quelle catégorie de corps la substance isolée devait appartenir.

D'autre part, les réactions colorées et l'analyse spectrophotométrique dans l'ultra-violet sont en accord avec ce qui peut être déduit des réactions physiologiques de la moelle de Tabac.

 

CONCLUSIONS

 

Trois groupes différents de substances de croissance existent dans le lait de Maïs, d'où elles ont été isolées à l'aide d'échangeurs d'ions mélangés. Ceci est acquis définitivement.

Le groupe basique peut lui-même être scindé en deux : un groupe comprenant les amphotères à tendance acide, qui manifeste une activité sur le test mésocotyle de NITSCH, et un groupe comprenant les amphotères basiques et les bases organiques, particulièrement les purines, qui stimule, en présence d'auxine, la division cellulaire de la moelle de Tabac. De ce dernier groupe a été isolée une substance non encore caractérisée, qui peut être classée avec certitude dans une catégorie de purines très voisine de l'adénine.

 

PROPRIÉTÉS PHYSIQUES ET CHIMIQUES

L'étude systématique des groupes acide et neutre n'ayant pas été poursuivie, les propriétés physiques et chimiques de leurs constituants ne sont pas encore connues.

Cependant il est possible de dire que les constituants actifs du groupe neutre dialysent et sont solubles dans l'alcool à 50%.

Il n'est surtout question ici que de la purine active isolée du lait de Maïs.

— Au cours de dialyse, cette substance traverse les membranes.

— Elle est soluble dans l'éthanol à 90% et insoluble dansl'éther.

— Elle donne dans l'U.V. un spectre d'absorption qui est caractéristique des purines, et très proche de celui de l'adénine.

— Substance basique, elle est très fortement retenue par les échangeurs de cations et son élution est longue. Par contre, en solution alcoolique à 50%, elle n'est pas fixée par les échangeurs basiques forts, type Dowex 2, contrairement aux amphotères.

— En électrophorèse plane, elle se déplace peu par rapport aux bases organiques comme l'histidine ou l'arginine.

— Avec les sels d'argent, en présence de bleu de bromophénol, ou avec les sels de mercure, elle donne des complexes comme les bases nucléiques.

— Grâce à ces réactions caractéristiques, sa présence peut être révélée sur les bandes d'électrophorèse.

Outre son absorption dans l'U.V., elle émet une fluorescence qui permet également de la repérer dans le cas d'électrophorèse sur amidon.

 

PROPRIÉTÉS PHYSIOLOGIQUES

Voici d'abord un aperçu très bref de l'activité des groupes acide et neutre isolés du lait de Maïs.

 

Activité de la fraction acide.

Le groupe acide n'a pas été étudié en détail au cours de cette recherche. Il contient les auxines acides, et d'autres substances non déterminées, actives sur le test mésocotyle de NITSCH.

 

Activité de la fraction neutre.

La fraction neutre agit sur l'élongation du test, mésocotyle de NITSCH et stimule la division cellulaire de la moelle de Tabac. Son action sur ce point est plus rapide que celle de la «purine active» isolée de la fraction basique, mais elle ne provoque jamais de formation de bourgeons ni de racines.

 

Activité de la « purine active » du lait de Maïs.

Cette substance active est non seulement inductrice de division cellulaire dans les tissus incapables de proliférer par eux-mêmes, mais peut encore provoquer l'apparition de bourgeons sur de tels tissus (moelle de Tabac). Ces bourgeons repiqués en serre ont donné des plantes adultes et des graines fertiles.

Cette propriété qu'elle a de favoriser la division cellulaire de tissus qui en ont perdu la possibilité, est peut-être due au fait que sa constitution chimique serait proche de celle de certaines bases nucléiques. Ceci permettrait son intégration relativement rapide dans la synthèse de molécules d'acides nucléiques, et ainsi pourrait déclencher le processus de la multiplication de la masse d'acide nucléique, et par suite celle des noyaux.

Son action sur la moelle de Tabac ne se manifeste qu'en présence d'auxine, mais sur des fragments de tige, l'action de ces deux substances est antagoniste. Il ne se forme ni racine» ni bourgeons, mais un cal.

Au cours de ces recherches, des dosages d'A.D.N., quoique sommaires, ont permis de mettre en évidence une action directe de cette substance sur la synthèse de la masse totale des nucléoprotéines, envisagées surtout du point de vue acide désoxyribonucléique. Cet effet se manifeste même dans le cas de concentration limite, au point de vue activité, de cette purine active isolée de la fraction basique du lait de Maïs.

Au cours de cette étude, il apparaît que cette substance est plus active sur la division cellulaire (caryocinèse et cytocinèse) que la kinétine étudiée par MILLER et ses collaborateurs. Elle provoque également, plus rapidement que la kinétine, l'apparition de bourgeons sur le tissu de moelle de Tabac cultivé «in vitro».

Il reste à savoir comment cette « purine active » s'introduit dans le métabolisme des tissus ; est-ce à la manière d'un élément qui prendrait place dans un édifice, comme une pierre dans un mur (élément statique) ? Dans ce cas la croissance liée à la présence de cette substance se ralentirait dès qu'elle a disparu.

Ou, au contraire, sa présence facilite-t-elle la synthèse des acides nucléiques, ou provoque-t-elle la mise en route d'activités catalytiques spécifiquement orientées vers l'accroissement des nucléoprotéines elles-mêmes ? Les tissus devraient alors conserver une activité de division cellulaire sur des milieux d'où cette substance aurait été exclue.

Des tissus de moelle de Tabac cultivés d'abord sur du lait de Maïs ou sur la «purine active», et repiqués sur des milieux sans lait de Maïs, avec ou sans auxines, ont manifesté une activité propre de division cellulaire qui s'est poursuivie pendant au moins deux repiquages. Sur le milieu sans auxine la croissance des tissus< a été limitée, mais des ébauches de bourgeons sont apparues.

Ces faits seraient plutôt en faveur de l'action dynamique de la «purine active», mais cette hypothèse nécessite une confirmation qui ne pourra être obtenue qu'avec de nouvelles recherches.

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